Hormonalne domino

Międzynarodowy zespół naukowców z biologami z UMK w składzie odkrył aktywność cyklazy adenylanowej w receptorze auksyn. To przełom w badaniach nad sygnalizacją hormonalną roślin.

Gdy człowiek się uderzy, poczuje ból. Pomiędzy tymi zdarzeniami dochodzi do szeregu reakcji pośrednich – przekaźnikowych. Analogiczny układ zwany transdukcją sygnałów występuje u wszystkich żywych organizmów, w tym roślin. Kiedy pojawia się bodziec, np. czynnik suszy czy atak patogenu, roślina odbiera tę informację za pomocą receptora, analizuje, czasami wzmacnia i formuje adekwatną odpowiedź. Tak więc sygnał płynący z receptora uruchamia wiele elementów, takich jak białka, jony, związki niskocząsteczkowe, za pomocą których przekazuje informację na efektor, formujący odpowiedź. Wiadomość podąża określoną drogą, z elementu na element, co wymaga uruchomienia swoistej "Google Maps".

Roślinne domino

- To jest jak domino – tłumaczy dr hab. Krzysztof Jaworski, prof. UMK z Katedry Fizjologii Roślin i Biotechnologii na Wydziale Nauk Biologicznych i Weterynaryjnych toruńskiego uniwersytetu. - Czynnik sprawczy, w naszym przypadku hormon roślinny auksyna, główny wewnątrzkomórkowy regulator wzrostu i rozwoju roślin, jest jak palec, który popycha klocki domina. Pierwszym klockiem jest receptor, którego uruchomienie porusza kolejne klocki. Na końcu tego łańcucha jest piłeczka, czynnik finalny, który zmienia ekspresję określonego zestawu genów, hamując bądź uruchamiając powstawanie białek wpływających na ostateczną odpowiedź fizjologiczną organizmu. Okazało się jednak, że wiedza na temat budowy i funkcjonowania pierwszego klocka, receptora auksyny, była niekompletna, a działanie palca, czyli auksyny, bardziej skomplikowane, co udowadniamy w naszych badaniach.

Naukowcy wiedzieli, że drugi klocek przewraca się, ale nie do końca znali mechanizm, za sprawą którego pierwszy klocek jest w stanie przekazać siłę na kolejny. Aby to nastąiło, musi zadziałać cyklaza adenylanowa, o której badacze dotychczas nie wiedzieli.

Cyklaza adenylanowa to enzym wytwarzający cząsteczki cyklicznego AMP (cAMP) z ATP. cAMP natomiast to związek chemiczny, cząsteczka sygnalizacyjna, która łącząc się z białkami, zmienia ich aktywność, co prowadzi do przearanżowania procesów komórkowych.

- Przez 20 lat naukowcy uważali, że receptory auksyn nie posiadają innej wewnątrzcząsteczkowej aktywności – dodaje mgr Mateusz Kwiatkowski, doktorant prof. Jaworskiego. – Udowodniliśmy, że jednak mają, posiadają domenę o aktywności cyklazy adenylanowej, chociaż procesy w których uczestniczy cyklaza i jej produkt, czyli cAMP, nie są do końca poznane. Z pewnością wpływają na fenotyp, czyli wygląd roślin, głównie korzeni. Uczestniczą w zahamowaniu wzrostu korzenia w odpowiedzi na grawitropizm (reakcja organów roślinnych na zmianę ich położenia względem wektora grawitacji. Przykładem może być umieszczenie rośliny w położeniu horyzontalnym - jej pęd główny wzniesie się, a korzeń skieruje się w dół – red.)

Wyniki badań międzynarodowego zespołu zostały opublikowane w artykule "Adenylate cyclase activity of TIR1/AFB auxin receptors in plants", który ukazał się w listopadowym wydaniu czasopisma "Nature".

Oprócz Polaków w skład grupy weszli: Charo del Genio z Coventry University, Martin Kubeš i Richard Napier z University of Warwick, Huihuang Chen, Lukas Hoermayer, Scott Sinclair, Minxia Zou oraz Linlin Qi i Jiří Friml z Institute of Science and Technology z Austrii, główni pomysłodawcy projektu.

Inicjatywa współpracy wyszła od prof. Frimla, światowego autorytetu w tematyce auksyn. Z kolei naukowcy z UMK mają duże doświadczenie w obszarze roślinnych cyklicznych nukleotydów, ich oznaczania, analiz cyklaz i fosfodiesteraz, czyli enzymów zaangażowanych w ich metabolizm. Grupa pod kierownictwem prof. dr hab. Adriany Szmidt-Jaworskiej od ponad 15 lat poszerza wiedzą w tym temacie.

Początki były trudne. Byliśmy pionierami w poszukiwaniu roślinnych cyklaz adenylanowych – twierdzi prof. Jaworski. – Zaczęliśmy prowadzić badania i małymi sukcesami udowadniać, że mamy rację, że zarówno cykliczne nukleotydy, jak i cyklazy są integralnym elementem roślinnych szlaków transdukcji. Pracę ułatwiły nam odpowiednie narzędzia bioinformatyczne i czułe techniki detekcji, takie jak chromatografia cieczowa w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (LCMSMS) pozwalające na analizy ilościowe na poziomie pikomoli (10^-12).

Okazało się, że naukowcy z Austrii, korzystając z doświadczeń toruńskich badaczy i prof. Chrisa Gehringa z University of Perugia, w receptorze auksyn znaleźli domenę cyklazy adenylanowej. - Dostaliśmy konstrukty genetyczne z matrycą, na bazie której namnożyliśmy w bakteriach rekombinowane formy enzymu - wyjaśnia mgr Kwiatkowski. - Oczyściliśmy je i przeprowadziliśmy wszystkie niezbędne oznaczenia biochemiczne, wyznaczając kluczowe parametry reakcji enzymatycznej. Jednocześnie drogą mutagenezy kierunkowej dokonaliśmy zmian w budowie białka, tzn. sekwencyjnie bądź grupowo wyłączyliśmy trzy aminokwasy funkcyjne, co całkowicie zniosło aktywność badanej cyklazy adenylanowej.

- W naszych dotychczasowych badaniach cyklaz adenylanowych skupialiśmy się jedynie na aspekcie poznawczym, bez odnoszenia jej do roli fizjologicznej tej grupy enzymów – dodaje prof. Jaworski. – Natomiast artykuł w "Nature" łączy nasze dotychczasowe osiągnięcia i wkomponowuje je w istniejące roślinne systemy przekazywania informacji. A co ważniejsze zmienia nasze postrzeganie sygnalizacji fitohormonów. Sądzę, że lepiej nie można było trafić.

Nie tylko szum

Badania nad sygnalizacją komórkową roślin ruszyły na UMK prawie trzy dekady temu, kiedy biolodzy zaczęli analizować cząsteczki sygnalne. Jony wapnia oraz cykliczny AMP i GMP to tzw. przekaźniki informacji pojawiające się chwilowo w odpowiedzi na bodziec. Obecność cyklicznych nukleotydów w komórkach roślinnych stwierdzono już na początku lat 70. ubiegłego wieku. Pomimo pojawiania się kolejnych doniesień w tej tematyce wielu naukowców kwestionowało wyniki. - Sądzę, że obawy wynikały z bardzo niskich stężeń cyklicznych nukleotydów w komórkach roślinnych, które są 1000 razy niższe od tych odnotowanych w komórkach zwierzęcych – mówi prof. Jaworski. - Należy dodać, że przez wiele lat nie było narzędzi, które pozwalałyby na precyzyjne oznaczanie tak niskich stężeń. Dlatego część naukowców twierdziła, że to, co my rejestrowaliśmy, jest na granicy "szumu" aparatury pomiarowej. Obecnie wiemy, że w komórkach roślinnych cykliczne nukleotydy działają lokalnie, a niskie stężenia wydają się uzasadnione. Nie potrzeba ich więcej, mają pojawić się, zainicjować reakcję i zniknąć. Stąd też w sprawną regulację poziomu cAMP i cGMP zaangażowane są dwie grupy enzymów: cyklazy odpowiedzialne za ich syntezę oraz fosfodiesterazy zaangażowane w proces ich inaktywacji.

Niezaprzeczalnie przełomem w badaniach roślinnych cyklicznych nukleotydów było odkrycie tych grup enzymów. Rozpoczęcie badań zawdzięczamy prof. Gehringowi, który w 2003 r. wykazał eksperymentalnie, że w komórkach roślinnych istnieje enzym, który przeprowadza cyklizację GTP do cyklicznego GMP. Droga do sukcesu nie była łatwa, ponieważ mimo znanych sekwencji aminokwasowych i posiadanych odpowiednich narzędzi bioinformatycznych naukowcy nie mogli znaleźć podobieństwa pomiędzy dobrze scharakteryzowanymi cyklazami zwierzęcymi a potencjalnymi cyklazami roślinnymi.

Podobieństw tych szuka się na zasadzie porównywania sekwencji aminokwasowych – tłumaczy mgr Kwiatkowski.

Prof. Gehring poszedł inną drogą. Stwierdził, że jeżeli nie obserwujemy podobieństw sekwencji, to należy poszukać pewnych układów aminokwasów, tzw. aminokwasów funkcyjnych np. odpowiedzialnych za wiązanie substratów, kofaktorów. To był strzał w dziesiątkę. Używając różnych narzędzi i obserwując, jak są ułożone aminokwasy funkcyjne, profesor Gehring zaobserwował pewną zależność w ich układzie. Na bazie tego odkrycia stworzył motyw aminokwasów, tzw. motyw przeszukujący, który zezwalał na poszukiwanie i identyfikowanie domen białkowych charakterystycznych dla cyklaz.

Prof. Gehring w 2003 r. zidentyfikował i opisał pierwszą roślinną cyklazę guanylanową. Praca zespołu toruńskiego ukazała się jako druga. Z kolei zespół toruński w roku 2013 jako pierwszy scharakteryzował roślinną cyklazę adenylanową, do poszukiwania której stworzył własny motyw przeszukujący.

- Kiedy przeszliśmy do porównywania istniejących motywów w cyklazach roślinnych i zwierzęcych, okazało się, że mają one dwie zasadnicze różnice - mówi prof. Jaworski. - Po pierwsze ich budowa domenowa jest odmienna, a po drugie cyklazy roślinne nie stanowią pojedynczych białek, co jest bardzo powszechne w świecie zwierzęcym, a są częścią wielodomenowych białek funkcyjnych.

Są one określane jako moonlight, czyli takie, które mają co najmniej dwie funkcje. Już wiadomo, że domen o różnych funkcjach w jednym białku może być więcej, co mają potwierdzić kolejne badania toruńskich biologów. – Samo odkrycie takich enzymów nie zrobiło dużego zamieszania w świece nauki – przyznaje prof. Jaworski. – Trudno się przebić z informacją, gdy tylko kilka ośrodków zajmuje się tą tematyką - poza naszym zespołem są jeszcze tylko cztery inne na świecie. Na szczęście wszyscy ze sobą współpracujemy, tworząc – jak to określił jeden z kolegów – rodzinę cyklicznych nukleotydów. Teraz dołączył kolejny ośrodek w Europie (w Austrii – red.) i chociaż dopiero zaczyna przygodę z cyklazami i cyklicznymi nukleotydami, to razem wywracamy do góry nogami dotychczasową wiedzę w tematyce auksyn i cyklicznych nukleotydów. Pamiętam, że kiedy się to wszystko zaczynało, był tylko zespół prof. Gehringa i nasz, na UMK. Na początku była między nami rywalizacja, lecz bardzo szybko połączyliśmy siły. Kilkuletnia współpraca dobrze się układa i odnosimy sukcesy, z każdym rokiem coraz większe.

Zmiany w kanonie

Naukowcy niedawno wrócili z konferencji poświęconej tylko auksynom, w której uczestniczyło 150 specjalistów. Prezentowali tam wyniki swoich badań, które wzbudziły zainteresowanie.

Odkrycie domeny cyklazy w receptorze auksyn zmienia dotychczasowe, kanoniczne spojrzenie na transdukcję sygnału hormonalnego – mówi prof. Jaworski. – Teraz należy uwzględnić cykliczne nukleotydy, które zyskują rolę może nie pierwszorzędną, ale bardzo istotną.

Mgr Kwiatkowski przewiduje, że niebawem rozpocznie się poszukiwanie podobnych centrów aktywnych w innych fitohormonach. – W ciągu najbliższych kilku lat spojrzenie na fitohormonalną transdukcję sygnału roślin z pewnością ulegnie zmianie – twierdzi prof. Jaworski. - Jestem przekonany, że pójdzie to w kierunku, o którym mówi Mateusz. Mamy też podstawy sądzić, że receptor auksyn nie jest odosobnionym przypadkiem. Można spodziewać się, że większość białek o charakterze receptorowym może wykorzystywać podobny mechanizm uwzględniający udział cyklaz i cyklicznych nukleotydów. Niekoniecznie musi być to cyklaza adenylanowa, może być guanylowa, mechanizm jest ten sam, tylko substrat trochę inny.

- W kolejnych badaniach chcemy skupić się na poszukiwaniu efektorów, czyli białek oddziałujących z cAMP i cGMP oraz enzymów dezaktywujących tę cząsteczkę sygnalną. Gdy już osiągniemy ten cel, proces transdukcji sygnałów w komórkach roślinnych z udziałem fitohormonów i cyklicznych nukleotydów będzie mniej enigmatyczny – stwierdza mgr Kwiatkowski. (Mgr Kwiatkowski właśnie obronił pracę doktorską udowadniając istnienie fosfodiesteraz u roślin, czyli drugiej grupy enzymów zaangażowanych w metabolizm cyklicznych nukleotydów - red.).

Toruńscy naukowcy liczą, że po publikacji artykułu w "Nature" nikt nie będzie już kwestionował występowania cyklaz i cyklicznych nukleotydów u roślin. - Jestem niezwykle usatysfakcjonowany, że po tylu latach pracy okazało się, że to, co robiliśmy do tej pory, było słuszne – konkluduje prof. Jaworski. - Wiemy, że prof. Gehring też jest niezwykle zadowolony. Zwykł mawiać: jeśli są cykliczne nukleotydy, to nie ma innego wyjścia - muszą być enzymy regulujące jego poziom. Chociaż nie spodziewał się, że okaże się to tak skomplikowane. My również.